Dipartimento di Biologia/Biologia Molecolare

Laboratorio di Biologia Molecolare

Attività Scientifica

Meccanismi della regolazione traduzionale dei geni top

Vie di trasduzione del segnale nel controllo della crescita cellulare.

Meccanismi molecolari dell'anemia di blackfan-diamond

Regolazione della sintesi proteica alle sinapsi.

Meccanismi della regolazione traduzionale dei geni top
(F. Amaldi, F. Loreni, S. Caldarola)

La classe dei geni TOP include circa 100 geni tra cui tutti quelli che codificano per le proteine ribosomali e altri coinvolti nella produzione e funzione dell'apparato di traduzione. Tutti questi geni sono caratterizzati da un tipico 5'UTR che inizia con una sequenza di 6-12 pirimidine (Terminal OligoPyrimidine = TOP). Abbiamo dimostrato che questo caratteristico 5'UTR è implicato in un controllo traduzionale "growth-dependent" tipico di tutti i geni TOP. Infatti in cellule quiescenti solo il 20-30 % di ciascun TOP-mRNA è associata ai polisomi, mentre tale percentuale aumenta al 70-80 % in cellule in attiva crescita. Essendo state individuate due proteine, La e CNBP, che legano il 5'UTR dei TOP-mRNA, abbiamo studiato se esse sono coinvolte nella regolazione traduzionale. Per quanto riguarda la proteina La, che lega la sequenza di pirimidine nel 5'UTR degli mRNA TOP, abbiamo costruito delle linee cellulari trasfettate stabilmente che sovraesprimono La o forme mutanti di essa. Abbiamo così potuto dimostrare che La ha un ruolo positivo nella regolazione traduzione degli mRNA TOP in vivo. Parallelamente abbiamo analizzato anche il ruolo di CNBP mediante l'analisi dell'effetto di mutazioni nel sito di legame di tale proteina nel 5'UTR di mRNA TOP, ed abbiamno dimostrato che tali mutanti presentano una alterata regolazione traduzionale.

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Vie di trasduzione del segnale nel controllo della crescita cellulare.
(F.Amaldi, F.Loreni, S.Caldarola)

La crescita di una cellula eucariotica è regolata sia da sostanze presenti nell'ambiente extracellulare (fattori di crescita, ormoni ecc.) che dalla presenza, all'interno della cellula stessa, di molecole di "nutrimento", come amminoacidi e glucosio. In entrambi i casi, attraverso una rapida successione di eventi (essenzialmente attivazione/inattivazione di proteine segnale), si determina una modificazione, più o meno temporanea, dell'espressione genica in risposta alla disponibilità o mancanza di segnali. Tali segnali possono raggiungere: 1) il nucleo della cellula, determinando variazioni nella trascrizione di geni specifici, e 2) il citoplasma, alterando l'utilizzazione di specifici mRNA. La principale via di trasduzione del segnale all'apparato di sintesi proteica include le chinasi mTOR e S6K1. mTOR è un mediatore della rapida fosforilazione-defosforilazione della S6K1 in risposta a vari segnali; S6K1 (chinasi della proteina ribosomale S6) fosforila la proteina ribosomale S6 e la sua attivazione è correlata con stimolazioni della crescita cellulare. Inoltre mTOR e S6K1 sono anche coinvolte nella risposta della cellula alla disponibilità di amminoacidi. Uno dei bersagli a valle della via mTOR-S6K1 è il gruppo degli mRNA TOP (vedi sopra) la cui traduzione è regolata in modo dipendendente dalla crescita cellulare. Lo scopo della nostra ricerca è la comprensione dei meccanismi di segnale all'apparato di sintesi proteica in risposta a stimolazione della crescita cellulare. In particolare i nostri obiettivi sono: 1) stabilire un collegamento tra l'attivazione di S6K1 e la regolazione traduzionale degli mRNA TOP; 2) caratterizzare la risposta alla disponibilità di amminoacidi degli mRNA TOP; 3) analizzare la relazione tra regolazione traduzionale specifica degli mRNA TOP e la regolazione generale della sintesi proteica. A tale scopo abbiamo utilizzato linee cellulari in coltura (HeLa, HEK293) sottoposte a differenti condizioni di crescita: a) assenza o presenza di fattori di crescita; b) assenza o presenza di amminoacidi; c) presenza di inibitori specifici di vie di trasduzione del segnale (es. rapamicina). Le cellule sono state analizzate dal punto di vista della regolazione traduzionale degli mRNA TOP. I risultati hanno messo in evidenza che la regolazione traduzionale degli mRNA TOP è sotto il controllo di almeno due vie di trasduzione del segnale: una è quella già nota che coinvolge mTOR e S6K, l'altra, non ancora caratterizzata, determina l'inibizione traduzionale degli mRNA in risposta a carenze di amminoacidi.

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Meccanismi molecolari dell'anemia di blackfan-diamond
(F. Loreni, M. Angelini, A. Chatr-aryamontri)

L’anemia di Diamond Blackfan (DBA) è caratterizzata dalla diminuzione o assenza di precursori eritroidi. Mutazioni nella sequenza di RPS19 sono state evidenziate in circa il 25% dei casi. Le mutazioni di RPS19 nella DBA rappresentano il primo caso di alterazione in una RP nei vertebrati. Come sistema sperimentale, per studiare l’espressione di RPS19 nella DBA, abbiamo utilizzato diverse linee cellulari di pazienti DBA che presentano o meno la mutazione nel gene RPS19.
L’analisi del livello dell’mRNA di RPS19 ha evidenziato: 1) una diminuzione fino al 50% di tale messaggero nelle linee linfoblastoidi di individui malati di DBA con mutazioni in RPS19 che provocano l’assenza del codone di Stop o la presenza di un codone di Stop prematuro nell’mRNA di RPS19, 2) nessuna variazione nel livello dell’mRNA RPS19 nelle linee linfoblastoidi DBA senza mutazione nel gene e in fibroblasti primari con mutazioni missense. Nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che la diminuzione del messaggero di RPS19 è dovuta all’effetto del Non-sense Mediated Decay (NMD) e del Non-Stop Decay, meccanismi dipendenti dalla traduzione che degradano rispettivamente messaggeri che presentano alterazioni del codone di Stop. Tale analisi è stata condotta inibendo la traduzione e analizzando l’RNA estratto attraverso RT-PCR e Northern.
Risultati preliminari sulla quantità della proteina nelle diverse linee cellulari di pazienti DBA sembrano mostrare che il livello della proteina allo stato stazionario e' simile ai controlli.
Quindi ci sono due possibilità: i) l'RPS19 mRNA viene tradotto più efficientemente; ii) RPS19 viene stabilizzata o le altre componenti vengono destabilizzate. Per analizzare questo punto abbiamo già iniziato esperimenti volti a determinare la stabilità delle proteina RPS19, rispetto alle altre proteine ribosomali.
Stiamo anche studiando l’effetto delle mutazioni in RPS19 sulla maturazione dell’rRNA. Risultati preliminari evidenziano un accumulo di precursori rispetto agli rRNA maturi in alcune delle linee cellulari analizzate.

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Regolazione della sintesi proteica alle sinapsi.
(C. Bagni, C. Carosi, F. Ferrari, M. Veneri, F. Zalfa)

Uno dei principali interrogativi nelle neuroscienze è quello di comprendere come una cellula neuronale possa immagazzinare le precedenti esperienze e poi modificare la sua risposta di conseguenza: questa è la base dell’apprendimento e della memorizzazione. Recenti lavori hanno mostrato che un contributo cruciale a questi processi deriva dall’espressione proteica localizzata alla periferia delle cellule neuronali. Specifici RNA messaggeri sono trasportati dal corpo cellulare agli assoni e ai dendriti dove essi sono tradotti in una maniera regolata. Lo scopo della nostra ricerca è quello di comprendere come questo meccanismo possa contribuire ai processi di apprendimento e di memorizzazione. A tal fine tre grandi interrogativi devono essere presi in considerazione:

(a) La sintesi proteica è tipicamente citoplasmatica - come vengono trasportati ai dendriti o agli assoni i componenti di cui necessita il macchinario di sintesi proteica? In particolare, come sono selezionati i corretti RNA messaggeri? (b) Cosa dà l’avvio alla sintesi proteica localizzata a livello delle sinapsi? (c) Quali sono gli effetti a valle di questa traduzione regolata?
Negli ultimi cinque anni il mio gruppo di ricerca sta studiando le cause della sindrome dell’X Fragile, la più frequente causa di ritardo mentale ereditario (1:2500 maschi, 1:4000 femmine) legata all’assenza della Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). FMRP appartiene alla famiglia delle proteine che legano l’RNA ed è stata implicata nel controllo traduzionale alle sinapsi. Ma non è ancora chiaro come l’assenza di un regolatore traduzionale come FMRP possa portare ad un deficit nell’apprendimento e nella memorizzazione e quindi al ritardo mentale osservato nei pazienti affetti dalla sindrome. Lo studio della proteina FMRP tocca tutti gli aspetti della traduzione localizzata alle sinapsi e quindi offre un maggiore approfondimento nella comprensione di questo processo a) Trasporto degli mRNA/RNA dendritici
La sintesi proteica sinaptica è il processo finale di un meccanismo regolatorio multistep che coinvolge il targeting degli mRNA dendritici e la loro localizzazione. Solo per pochi di questi mRNA è stato mostrato che segnali cis-agenti nel 3’ UTR mediano il targeting. Noi stiamo focalizzando il nostro interesse su un certo numero di mRNA dendritici tra i quali c’è anche l’mRNA FMR1 che codifica per la Fragile X Mental Retardation Protein, FMRP. Noi abbiamo mostrato tramite ibridazione in situ a livello di microscopia elettronica che questo mRNA è associato con il reticolo endoplasmatico, con i microtubuli e con le spine dendritiche in vivo. Inoltre, abbiamo osservato che i neuroni in vivo esprimono tre isoforme dell’mRNA FMR1 generate tramite l’uso di siti di poliadenilazione alternativa. Stiamo ora verificando se una (o più) di queste forme venga specificamente indirizzata alle sinapsi. Questo implicherebbe la presenza di un processo post-trascrizionale che modula e regola la distribuzione subcellulare di un mRNA. L’alterazione di questo meccanismo può contribuire ai difetti di apprendimento osservati in alcuni pazienti con sindromi X Fragile simili che presentano un gene FMR1 non mutato.

b) Regolazione della sintesi proteica locale
Allo scopo di studiare la traduzione dell’mRNA alle sinapsi, noi abbiamo messo a punto un metodo per preparare i sinaptoneurosomi dal cervello di topo. Noi abbiamo mostrato che la sintesi proteica si verifica alle sinapsi e per alcuni mRNA essa si modifica dopo stimolazione chimica. Noi abbiamo investigato la funzione di FMRP alle sinapsi e abbiamo mostrato che FMRP agisce come un repressore traduzionale di specifici mRNA. Noi stiamo attualmente delucidando come FMRP assolva questa funzione attraverso la caratterizzazione delle molecole che essa lega. Un punto importante deriva dall’osservazione che il piccolo RNA dendritico e non tradotto BC1 (Brain Cytoplasmic1) è associato a FMRP. Il blocco di BC1 inibisce l’interazione di FMRP con i propri mRNA bersaglio. Inoltre, BC1 si lega direttamente a FMR1 e può anche associarsi, in assenza di qualunque proteina, con gli mRNA regolati da FMRP. Questo suggerisce un meccanismo dove BC1 può determinare la specificità di azione di FMRP permettendo a questa proteina di riconoscere i propri mRNA bersaglio. Quindi, quando FMRP non è presente, la mancata repressione traduzionale di specifici mRNA alle sinapsi può risultare nel fenotipo di disfunzione sinaptica caratteristico dei pazienti con X Fragile. È interessante notare che FMRP contatta l’RNA BC1 attraverso un nuovo dominio non canonico di legame all’RNA. Attualmente stiamo dissezionando i differenti componenti (RNA/proteine) che fanno parte del complesso di FMRP e che giocano un ruolo nella repressione traduzionale degli mRNA alle sinapsi. In primo luogo sarà condotta una purificazione e caratterizzazione su larga scala di tutte le putative proteine interagenti con FMRP nel cervello utilizzando la strategia del TAP tag. In secondo luogo sarà studiata in vivo l’interazione di FMRP con il piccolo RNA non codificante BC1; in particolar modo siamo interessati ad identificare le possibili modificazioni nucleotidiche di BC1 che possono regolare le interazioni FMRP/ mRNA.

c) Correlazione tra il pattern di espressione dei microRNA durante lo sviluppo e la sindrome dell’X Fragile
FMRP può interagire con le proteine Argonaute (Ago) in differenti sistemi. Questa interazione suggerisce che FMRP possa essere un componente essenziale del complesso RISC conservato in differenti specie. Recentemente, è stato dimostrato in Drosophila che la mancanza della proteina FMRP non impedisce la degradazione sequenza specifica indotta dagli RNAi, indicando che FMRP non è richiesta per l’attività di degradazione dell’mRNA nel complesso RISC. Quindi, FMRP può essere richiesta soltanto per la repressione traduzionale degli mRNA all’interno del complesso RISC. Questa ipotesi è anche consistente con il ben dimostrato ruolo di FMRP come repressore della traduzione.
Allo scopo di studiare l’interazione tra FMRP e il pattern regolatorio dei microRNA noi stiamo attualmente analizzando l’espressione di alcuni microRNA durante lo sviluppo in ceppi di topi wild type e FMR1 KO. Inoltre, utilizzando un approccio in silico putativi nuovi microRNA bersaglio di FMRP sono stati isolati e attualmente si sta studiando il loro profilo polisomiale.

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