Laboratorio di Genetica Applicata
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Attività Scientifica
Evoluzione dei Riordinamenti del Cariotipo
Regolazione della trascrizione e maturazione dei linfociti B
I processi di morte cellulare per apoptosi.
Evoluzione dei Riordinamenti del Cariotipo
(M. Rizzoni, B. Gustavino, S. Minissi, M. Scascitelli)
a) Citogenetica evoluzionistica. Questo filone di ricerca
riguarda i fattori che determinano l’espansione e l’accumulo
di più riordinamenti cromosomici che causano una sterilità
parziale in eterozigosi, per valutarne il possibile ruolo nella speciazione.
Mediante lo studio delle metafasi di spermatociti II di topi con cariotipo
ricostruito, eterozigoti per più fusioni centriche (1-4) si è
dimostrata, mediante le tecniche di Ibridazione In Situ Fluorescente (FISH)
e l’uso di sonde telomeriche, che la frequenza di spermatociti II
aneuploidi è più che proporzionale al numero di fusioni
centriche in eterozigosi, e che tendono a cosegregare in I divisione meiotica
i cromosomi della stessa forma (metacentrici fra loro e acrocentrici fra
loro), rendendo così più verosimile un ruolo cladistico
a tali riordinamenti cromosomici. Studiando la non-disgiunzione di specifici
cromosomi (1, 4, 6 e 14) negli stessi topi eterozigoti per una o più
fusioni centriche, mediante le tecniche FISH e l’uso di sonde "painting"
di cromosomi specifici, si è esclusa la presenza di interazioni
epistatiche, per l’induzione di gameti aneuploidi, fra le diverse
fusioni centriche in eterozgosi. Tali ricerche sono state condotte in
collaborazione con il dott. F. Spirito del Dipartimento di Genetica e
Biologia Molecolare "C. Darwin" dell'Università di Roma
"la Sapienza" e la dott. F. Pacchierotti della Divisione di
Tossicologia dell'ENEA nell’ambito di un programma di interesse
nazionale cofinanziato dal MIUR, in collaborazione con le Università
di Roma, la Sapienza, coordinatore nazionale e locale prof. E. Capanna,
Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo,e stanno proseguendo
con lo studio degli stessi fenomeni variando il background genetico e
cariotipico dei topi eterozigoti.
b) Mutagenesi ambientale. Questo filone di ricerche
riguarda l'uso del test dei micronuclei per studiare l'inquinamento da
agenti mutageni di corpi d'acqua, in particolare in relazione alla disinfezione
delle acque di superficie per la loro potabilizzazione, tenendo conto
della capacità del test dei micronuclei di mettere in evidenza
effetti clastogeni ed aneugeni..
Il test dei micronuclei in emazie circolanti di Cyprinus carpio e in apici
radicali di Vicia faba è stato utilizzato per valutare la formazione
di composti genotossici derivanti dalla disinfezione delle acque superficiali
destinate al consumo umano, effettuando la sperimentazione in un impianto
pilota presso l’impianto di potabilizzazione del Comune di Castiglione
del Lago (PG) che viene approvvigionato da acque superficiali (Lago Trasimeno)
con concentrazioni molto elevate di carbonio organico totale e di bromuri,
potenzialmente capaci di formare sottoprodotti mutageni reagendo con i
disinfettanti (NaClO, ClO2 e CH3-COOOH). Tali ricerche sono state condotte
in collaborazione con il prof. S. Cataudella, com il dott. Pancioni e
con la dott. M. Monfrinotti del Laboratorio di Ecologia Sperimentale e
Acquacultura di questo Dipartimento nell’ambito di un programma
di interesse nazionale cofinanziato dal MURST, in collaborazione con le
Università di Brescia, coordinatore nazionale e locale prof. S.
Monarca, Università di Parma, coordinatore prof. C. Rossi, Università
di Milano, coordinatore prof. L. Marabini, Università di Bologna,
coordinatore G. Cantelli Forti). È risultato che le acque del lago
Trasimeno disinfettate con NaClO e ClO2 manifestano un leggero ma non
trascurabile effetto genotossico Successivamente tali ricerche si sono
sviluppate, con le stesse collaborazioni, indagando con il test dei micronuclei
in emazie circolanti di Cyprinus carpio e in apici radicali di Vicia faba
l’effetto genotossico delle acque condottate in diverse città
italiane e di trattamenti in laboratorio di soluzioni di acidi umici commerciali
addizionati con gli stessi disinfettanti.
Regolazione della trascrizione e maturazione dei
linfociti B
(Domenico Frezza)
Stiamo sviluppando una ricerca sul ruolo del polimorfismo dell’enhancer
HS1,2 nella maturazione e trascrizione delle immunoglobuline dei linfociti
B umani.
Abbiamo utilizzato vari approcci per studiare le funzioni dei polimorfismi
della regione regolativa della catena pesante delle immunoglobuline (Ig)
in relazione con la maturazione e trascrizione delle immunoglobuline.
Approccio strutturale: Abbiamo analizzato la regione regolativa delle
immunoglobuline clonando e sequenziando da alcune centinaia di genomi
i polimorfismi presenti in questa regione per poterli definire. Questo
studio ci ha permesso di identificare in maniera precisa ed esaustiva
come si sia trasformata la regione regolativa duplicata al 3’ dei
quattro geni delle catene pesanti.
Una copia dell’ enhancer HS1,2 è presente in ognuna delle
due regioni di controllo a valle dei due “clusters” duplicati
dei geni costanti delle Ig. Le due regioni regolative sono praticamente
identiche derivate dalla duplicazione dell’intero cluster e costituite
da tre enhancers di cui solo quello centrale HS1,2 è polimorfico.
La regione regolativa che sta al 3’ del cluster dei quattro geni
?1, ? 3, ?? ed ?1, contiene una copia dell’enhancer HS1,2 polimorfica
con una variabilità notevole delle frequenze dei 4 alleli identificati
nelle undici popolazioni studiate. Invece la regione a valle del cluster
contenente i geni ?4, ?2, ? ed ?2 contiene una copia di HS1,2 estremamente
poco variabile nella frequenza dei due alleli identificati per questo
locus. Le forme polimorfiche dei 4 alleli sono costituite da elementi
di 38 paia di basi ripetute da una a quattro volte e che contengono delle
“consensus” per alcuni fattori di trascrizione. In vitro alcuni
di questi fattori sono stati identificati. In alcuni casi i vari fattori
cooperano dando origine ad alcuni complessi che legano specificamente
queste sequenze di DNA.
Gli altri due enhancers che completano queste due regioni regolative chiamate
IgH3’EC (Immunoglobulin heavy chain 3’ enhancer complex) non
sono polimorfici, però hanno una funzione sinergica molto importante.
Questi due enhancer ai lati di HS1,2 sono anch’essi omologhi a quelli
del topo e del ratto e si chiamano HS3 ed HS4. HS sta per hyper-sensitivity
to DNAse I che è l’enzima usato per fare il saggio per identificare
gli enhancers nel genoma.
Lo studio dei polimorfismi e della struttura nei primati (in collaborazione
con i Dott. M.Cristina Riviello CNR e Dott. Klaus Fredrick, fondazione
Bioparco di Roma) ci è servita per studiare quale fosse il gene
ancestrale e come eventualmente le differenti strutture possano influenzare
la funzione con le variazioni delle sequenze “consensus” per
i fattori di trascrizione. Lo studio della distribuzione degli alleli
in collaborazione con i Prof. Olga Rickards e Cristina Martinez-Labarga
del gruppo di Antropologia Molecolare di questo Dipartimento, è
stato sviluppato su un gruppo di undici popolazioni umane dei continenti
del vecchio mondo per stabilire la presenza di eventuali clini. E’
risultato che gli alleli di HS1,2 sono altamente utili come marcatori
antropogenetici.
Approccio funzionale: Gli enhancers che studiamo sono attivi nella fase
finale della maturazione dei linfociti B e cioè sia durante la
trascrizione sterile dei geni costanti durante lo switch isotipico, sia
per la trascrizione a livello di plasma cellule, praticamente da quando
l’enhancer al 5’I E? perde attività. Non si conoscono
precisamente quali fattori interagiscano con l’enhancer più
al 5’ per cui si spenge a favore di quelli al 3’, ma si pensa
che il meccanismo dipenda dalla regolazione sia dei fattori di trascrizione
specifici attivanti che da fattori inattivanti come BSAP dopo la fase
iniziale.
La scelta di studiare la correlazione delle frequenze alleliche di HS1,2
in patologie di tipo immunologico nasce dalla possibilità di individuare
dei meccanismi alterati nelle patologie (alcuni già noti od ipotizzati)
per vedere se alcuni di questi influenzano l’attivazione di quei
fattori di trascrizione essenziali temporalmente e quantitativamente per
il corretto funzionamento dell’enhancer con i suoi diversi alleli.
La possibilità di adottare nuove tecniche di studio di tipo olistico
come l’analisi del trascrittoma con “microarrays” apre
nuove strade sopratutto per poter studiare la contemporaneità di
interazione di molti fattori proteici. In questo modello abbiamo interleukine,
recettori, fattori di trascrizione e cofattori che interagiscono per la
maturazione dei linfociti B anche tramite la regolazione dei fattori di
trascrizione che devono legare l’enhancer HS1,2 per la produzione
delle Ig .
Attualmente abbiamo in programma di studiare con “microarrays”
la variazione del trascrittoma in cellule B normali e patologiche con
stimolazione utilizzando cellule in omozigosi per gli alleli di HS1,2
(collaborazione con il Dott. Mario Pescatori, Progetto Telethon c/o Università
Cattolica di Roma e con il gruppo del Prof. Vittorio Colizzi di questo
Dipartimento).
Fino ad ora abbiamo osservato una significativa correlazione della variazione
della frequenza dei 4 alleli di HS1,2-A (situato al 3’ di alfa-1)
in almeno tre patologie (celiachia/dermatite erpetiforme, sclerosi sistemica,
sindrome di Crohn), mentre un gruppo francese ha trovato l’aumento
della frequenza dello stesso allele nella nefropatia di Berger (collaborazioni
con la clinica di Gastroenterologia di Tor Vergata, Prof. Franco Pallone
e Prof. Livia Biancone).
Insieme al gruppo del Prof. Gianfranco Ferraccioli (clinica Reumatologica
della Università Cattolica di Roma) stiamo studiando sia la sclerosi
sitemica che la LES ed AR. Con il Prof. Franco Pandolfi (Immunologia molecolare
della Università cattolica di Roma) e Plebani (Immunologia della
Università di Brescia) stiamo analizzando la deplezione di IgA
ed altre possibili immunoalterazioni.
In collaborazione con la clinica Psichiatrica di TorVergata (Prof. M.Rubino
e A.Siracusano) stiamo studiando le immunoalterazioni dei pazienti affetti
da Schizofrenia. In collaborazioni con i Prof. G.Federici e R. Massoud
di Biochimica clinica del policlinico di Tor Vergata stiamo studiando
le alterazioni di produzione di immunoglobuline nella popolazione del
centro Italia.
a) Il problema della tracciabilita' dei prodotti biologici
sta diventando sempre piu' cogente, stiamo sviluppando dei metodi piu'
rapidi ed adeguati per l'estrazione del DNA da vari tessuti animali (compreso
da pelo di mammifero) su cui fare il test dei microsatelliti per il riconoscimento
su base molecolare degli animali. Abbiamo applicato a campioni di DNA
estratti da diversi tessuti il test per il riconoscimento di microsatelliti
polimorfici bovini, per verificare la ripetibilita' ed affidabilità
del test.
b) La sicurezza dei mangimi per gli animali da allevamento
e' diventata essenziale dopo la grave epidemia di BSE. Stiamo sviluppando
dei nuovi tests qualitativi e quantitativi tramite PCR per la determinazione
della presenza nei mangimi di tessuto di bovini, ruminanti, mammiferi
e vertebrati. Questi tests sono stati messi a punto per l'amplificazione
di frammenti di DNA mitocondriale in quanto piu' abbondante nei tessuti
e rilevabile anche dopo i trattamenti termici richiesti dalle normative
europee. In collaborazione con il Dipartimento di Veterinaria dell’Istituto
superiore di Sanità (Dott. G.Vaccari, B.Chiappini, GF.Brambilla)
abbiamo sviluppato un metodo quantitativo competitivo per misurare la
presenza di materiale bovino in mangimi animali di vario tipo. Questi
risultati sono stati ottenuti con il finanziamento del progetto Europeo
STRATFEED. Il progetto in collaborazione con gli Istituti Zooprofilattici
Sperimentali di Brescia (Dott. E.Faggionato, N.Losio) e di Roma (Dott.
L.Lanni, S.Saccares) ed il Prof. Paolo Ajmone Marsan (Istituto di Zootecnia,
Università cattolica di Piacenza) finanziato con i fondi del Ministero
della Sanità Ricerca Corrente 2002-2003, ci ha permesso di sviluppare
i primers per poter amplificare tramite PCR real-time Light-Cycler 6 diverse
specie di mammifero ed un numero ampio di specie ittiche e vegetali (primers
universali). Questo nuovo metodo quantitativo oltre ad essere particolarmente
rapido e sensibile permette un’analisi ancora più efficace
di una PCR classica per la presenza di una sonda fluorescente che aumenta
la specificità dell’analisi determinando la rivelazione solamente
dei frammenti che contengono questa terza sequenza specifica.
I processi di morte cellulare per apoptosi
( S. Coppola, , M. De Nicola, L. Ghibelli)
a) Meccansimi intrinseci
Stiamo studiando la trasduzione del segnale apoptotico in modelli di linee
cellulari, con lo scopo di capire le connessioni tra i vari eventi che
hano luogo durante la propagazione del segnale apoptotico intracellulare
innescato da agenti danneggianti. Il nostro approccio e’ quello
di risalire dall’osservazione fenomenologica e morfologica, indietro
fino a chiarire i meccanismi biochimico/molecolari che li causano. Negli
anni in esame, abbiamo chiarito alcune correlazioni finora non note, tra
differenti eventi intracellulari del processo di segnalazione apoptotica,
concentrandoci in partiucolare su flussi di Ca2+; modulazioni redox,vescicolazione
nucleare; modificazioni post-traduzionali per ADP-ribosilazione; fenomeni
proteolitici.
b) Ruolo del processo di apoptosi in patologia e sue implicazioni
Abbiamo portato avanti dei discorsi con ricaduta medico-applicativa. Due
di tali studi consistono nell'analisi della frequenza di apoptosi tra
i leucociti periferici del sangue in certe particolari circostanze, analisi
complementata con la ricerca dei fattori responsabili di tale evento.
Nel primo, abbiamo osservato che nelle sacche di sangue conservate per
la trasfusione, tra i linfociti residui presenti nella componente eritrocitaria,
si verifica un accumulo di apoptosi con contemporaneo aumento dei livelli
di alcune citochine. Nell'altro studio, abbiamo osservato un abnorme numero
di cellule apoptotiche tra i leucociti del sangue di pazienti nefropatici
sottoposti ad emodialisi, dovuto ad un fattore capace di indurre apoptosi
redox-modulata in sistemi reporter.
Per quanto riguarda l’AIDS, abbiamo analizzato il ruolo dell’apoptosi
nei macrofagi umani infettati dal virus HIV. Inoltre, stiamo analizzando
il possibile ruolo antiapoptotico di alcuni dei farmaci antiretrovirali
in uso nelle “highly active therapies” [paper submitted].
Abbiamo inoltre affrontato il ruolo dell’apoptosi nel contribuire
al turnover cellulare delle cellule di muscolo liscio dell’aorta,
con lo sopo di identificare possibili interventi terapeuci atti a prevenire/contenere
l’ipertensione arteriosa [paper submitted].
Infine, stiamo analizzando il meccanismo di induzione di apoptosi da parte
di un fattore di natura proteica prodotto da macrofagi con uno spiccata
preferenza di azione verso cellule tumorali. Abbiamo isolato un peptide
di 7.4 Kd, che mantiene completa attivita’ citocida
c) L’esposizione a campi elettro-magnetici inibisce l’apoptosi:
e’ questo il meccanismo attraverso il quale l’esposizione
a campi magnetici aumenta la frequenza di tumori?
Un nuovo filone delle nostre ricerche ci ha permesso di osservare e dimostrare
che la presenza di campi magnetici fortemente riduce l'entita' di apoptosi
indotta da trattamenti danneggianti su culture di cellule di vario tipo.
Il meccanismo con cui i campi magnetici riducono l'apoptosi e' l'aumento
di particolari flussi dello ione Ca2+ (flussi cosiddetti capacitativi)
attraverso la membrana plasmatica. La riduzione di apoptosi e' accompagnata
da un aumento della clonogenicita'; quindi, i campi magnetici aumentano
la sopravvivenza di cellule danneggiate, possibilmente mutate. Il lavoro
che descrive tali risultati, fornisce la prima possibile spiegazione agli
studi epidemiologici secondo i quali l'esposizione a campi magnetici aumenta
la frequenza di alcuni tipi di tumori. Stiamo ora indagando sui possibili
meccanismi alla base degli effetti descritti, e sulle possibili relazioni
tra gli eventi cellulari da noi osservati e i fenomeni di aumento di patologie
neoplastiche a seguito di esposizione a campi magnetici descritti dagli
epidemiologi.
