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Laboratorio di Morfologia
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Attività Scientifica
Analisi sperimentale di processi rigenerativi in Anfibi
Rigenerazione a livello del SNC
Analisi sperimentale di processi rigenerativi
in Anfibi
Gli Anfibi urodeli sono gli unici tetrapodi dotati di elevate capacità di rigenerare strutture complesse (appendici, varie regioni dell’occhio e del sistema nervoso centrale) anche allo stato adulto. Invece negli Anfibi anuri il potere rigenerativo è notevole negli stadi larvali precoci, ma decresce durante la vita larvale e diviene molto limitato dopo la metamorfosi. Pertanto, gli Anuri sono un modello sperimentale molto utile per comprendere quali sono le cause che hanno determinato la perdita del potere rigenerativo. Esse devono essere intervenute nel corso dell’evoluzione dei Vertebrati, dato che la capacità di rigenerare strutture complesse si è molto ridotta nei Rettili ed è scomparsa negli Uccelli e nei Mammiferi. L’altro fondamentale problema, strettamente collegato al primo, è quello di capire se, e in quale misura, lo sviluppo e la rigenerazione sono processi distinti o sono diretti dagli stessi geni. Tali problemi possono essere affrontati utilizzando modelli sperimentali in cui siano stati estesamente studiati i processi ontogenetici. Le nostre ricerche riguardano l’analisi causale della rigenerazione dell’ARTO, dell’OCCHIO e del Sistema nervoso Centrale (SNC) negli Anfibi e in particolare in Xenopus laevis, la specie che, fra gli Anuri, manifesta le più elevate capacità rigenerative.
Il decremento della capacità rigenerativa dell’arto di X. laevis nel corso della vita larvale non è correlato con il decremento dell’innervazione, come era stato precedentemente supposto da altri Autori, poiché arti precoci denervati formano blastemi rigenerativi con potenzialità morfogenetiche superiori a quelle di blastemi di arti tardivi innervati. Sulla base dei dati ottenuti negli Urodeli, che dimostrano che fattori liberati dalle fibre nervose (fattore/i neurotrofico di Singer) sono indispensabili per la formazione del blastema, abbiamo supposto che la formazione di un blastema nervo-indipendente sia dovuta alla produzione, da parte delle cellule indifferenziate degli arti precoci, di fattori mitogeni in grado di imitare quelli liberati dai nervi. In accordo con questa ipotesi, arti precoci amputati e denervati imitano la retina nel promuovere il transdifferenziamento lentogeno di impianti di frammenti di cornea, mentre arti tardivi amputati e denervati non sono in grado di farlo. Successive ricerche, basate sull’impianto di frammenti di tessuto nervoso o di arti precoci e tardivi in blastemi di arti tardivi, nervo-dipendenti, denervati, hanno dimostrato che l’impianto di frammenti di arti precoci manteneva la proliferazione cellulare nei blastemi denervati in maniera simile all’impianto di frammenti di midollo spinale. Invece, l’impianto di frammenti di arti tardivi non aveva alcun effetto. Questi risultati indicano che la nervo-indipendenza degli arti precoci è dovuta alla sintesi di fattori mitogeni diffusibili neurotrofico simili e che la nervo-dipendenza degli arti tardivi è dovuta all’esaurimento della popolazione di cellule indifferenziate ed alla conseguente caduta del livello dei fattori mitogeni tissutali. Mediante RT-PCR, ibridazione in situ ed impianto di sferule di resina imbibite con FGF-2 o con anti-FGF-2, abbiamo dimostrato che fgf-2 mRNA è presente nei tessuti dell’arto e che il suo livello con l’estensione della popolazione di cellule mesenchimatiche. Dopo amputazione e denervazione, la sintesi di fgf-2 mRNA aumenta negli arti precoci, ma non negli arti tardivi. L’impianto di sferule contenenti anti-FGF-2 in arti precoci amputati inibisce la formazione del blastema, mentre l’impianto di sferule contenenti FGF-2 in arti tardivi amputati e denervati contrasta l’inibizione della mitosi nelle cellule del blastema, indotta dalla denervazione. Questi dati indicano che FGF-2 è un buon candidato come fattore mitogenico endogeno, responsabile della nervo-indipendenza degli arti precoci. Le attuali ricerche riguardano l’analisi delle relazioni epitelio-mesenchimatiche a livello dell’arto in sviluppo e in rigenerazione allo scopo di chiarire le cause del decremento del potere rigenerativo dell’arto col progredire dello sviluppo larvale. Il differenziamento potrebbe comportare modificazioni a livello dell’epidermide dell’arto e/o dei tessuti mesenchimatici sottostanti, tali da non consentire l’instaurarsi delle corrette interazioni epitelio-mesenchimatiche e la riattivazione dei geni implicati nei processi rigenerativi. A tale scopo, mediante RT-PCR ed ibridazione in situ viene analizzata l’espressione di alcuni geni coinvolti nella rigenerazione dell’arto su arti chimerici costruiti in seguito a trapianto di pelle fra arti precoci e tardivi.
Il processo di formazione della lente dei Vertebrati comporta una estesa serie di interazioni cellulari. Durante la neurulazione, l’ectoderma presuntivo della lente (EPL) subisce una serie di interazioni tissutali in seguito alle quali acquisisce la “tendenza” e la “specificazione” lentogena. Il differenziamento della lente, che inizia con la formazione del placode lentogeno allo stadio di bottone codale, è caratterizzato dalla sintesi delle cristalline, le proteine predominanti della lente. Recenti ricerche genetico/molecolari hanno identificato alcuni geni che sono implicati nelle fasi precoce e tardiva dello sviluppo della lente. In particolare, prima Otx-2 e poi Pax-6 sono attivati nell’ EPL durante il periodo in cui viene acquisita la “tendenza”, mentre Sox-3, un membro della famiglia dei geni Sox richiesti per l’attivazione dei geni delle cristalline, è attivato durante la “specificazione”. Il transdifferenziamento lentogeno della cornea in lente (chiamato anche rigenerazione della lente) è un fenomeno che avviene nelle larve di X. laevis dopo lentectomia. La nuova lente si forma dallo strato interno della cornea esterna. Questo processo è promosso da fattori prodotti dalla retina neurale e accumulati nella camera vitrea. Attraverso l’analisi genetico/molecolare del transdifferenziamento della cornea in lente e dell’epitelio pigmentato retinico o irideo in retina, in larve di X. laevis, ci proponiamo di chiarire: a) il ruolo delle interazioni tissutali che avvengono durante lo sviluppo nell’acquisizione della capacità rigenerativa; b) se i processi di transdifferenziamento dei tessuti oculari comportano la riattivazione di geni che svolgono un ruolo chiave nello sviluppo dell’occhio. Dati recenti dimostrano che la capacità della cornea esterna larvale di rigenerare il cristallino è il risultato sia dei segnali induttivi precoci che agiscono durante l’acquisizione della “tendenza” e della “specificazione” dell’ EPL, sia dei segnali induttivi tardivi che agiscono durante la formazione della cornea. Inoltre, sia i segnali induttivi precoci sia i segnali induttivi tardivi sono in grado, da soli, di far insorgere tale capacità.
Negli Anuri, l’epitelio pigmentato della retina e l’epitelio dell’iride hanno la capacità di transdifferenziare in retina neurale sotto l’influenza di induttori presenti nella camera vitrea. E’ stato dimostrato che FGF-2 è in grado di promuovere il transdifferenziamento dell’epitelio pigmentato di larve di X. laevis in neuroni retinici e cellule della glia. Tuttavia, non sono state ancora compiute ricerche relative al controllo genetico del transdifferenziamento retinico. Ci proponiamo di analizzare, nell’epitelio pigmentato della retina e dell’iride transdifferenzianti, il pattern spazio-temporale dell’espressione di geni coinvolti nello sviluppo della retina.
Rigenerazione a livello del SNC
Viene valutata, a vari stadi larvali, l’entità della riacquisizione di caratteristiche embrionali da parte delle cellule ependimali responsabili della rigenerazione di varie regioni del SNC in X. laevis, analizzando, durante il processo rigenerativo, l’espressione di geni coinvolti durante lo sviluppo del SNC. Recenti ricerche riguardano lo studio dell’effetto dell’acido retinoico (morfogeno che specifica le caratteristiche regionali del tubo neurale dell’embrione di X. laevis inibendo i geni espressi anteriormente) sul processo rigenerativo. Durante il processo rigenerativo, il livello di espressione di Otx2 nel telencefalo, mesencefalo e cervelletto e quello di Pax6 nel telencefalo e nel cervelletto s’innalzano notevolmente. Analogamente a quanto avviene durante lo sviluppo, il trattamento con RP influenza l’espressione di questi geni, inibendo quella di Otx2 e incrementando quella di Pax6, nelle suddette regioni encefaliche.
