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Laboratorio di Patologia Generale e Molecolare
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Attività Scientifica
L'obiettivo principale del nostro laboratorio è di studiare
a livello cellulare e molecolare l'interazione ospite-patogeno con particolare
riferimento alle infezioni da HIV e da Micobacterium tuberculosis (MTB).
In particolare, l'attività di ricerca del laboratorio si articola sia nella
definizione dei meccanismi patogenetici (progetti 2, 3) che nella identificazione
di nuovi correlati di protezione (progetti 4).
Infine, da qualche anno il nostro laboratorio è impegnato con altri gruppi
in Costa D'Avorio per lo sviluppo di un vaccino pediatrico anti-HIV/AIDS (progetto
1).
Ruolo dell’apoptosi indotta da MTB in monociti/macrofagi.
Ruolo della risposta immunitaria innata in corso di infezione da M. tuberculosis.
Sommario. La ricerca nell’Africa dell’Ovest ha identificato
epitopi virali critici per la risposta immune cellulare negli adulti. Attualmente,
stiamo cercando di analizzare se tali epitopi vengono riconosciuti anche
da bambini nati da madri sieropositive. L’ipotesi di questo progetto
attualmente in corso d’opera è che alti livelli di risposta
possano essere indotti attraverso una vaccinazione post-esposizione di neonati
e che queste risposte possano prevenire o rallentare il decorso dell’infezione
da HIV. In questo contesto, svilupperemo e analizzeremo un vaccino pediatrico
post-esposizione per i paesi dell’Africa dell’Ovest, in regioni
dove il trattamento antiretrovirale da solo si è rivelato insufficiente
per controllare la trasmissione materno infantile.
Razionale del vaccino. La trasmissione materno-infantile continua nei paesi
dell’Africa dell’Ovest ed è solo parzialmente controllata
dalla terapia antiretrovirale prenatale. La vaccinazione efficace di neonati
da madri sieropositive può fornire sufficiente protezione durante
il primo periodo di vita. Un vaccino pediatrico è considerato post-esposizione
in bambini nati da madri sieropositive anche se non tutti i bambini saranno
infettati in assenza di vaccinazione o terapia. L’uso di un vaccino
basato su peptidi offre la possibilità di minimizzare i rischi intrinseci
legati ai vaccini classici e di identificare bersagli proteici virali conosciuti.
Tuttavia, i peptidi da soli non sono sufficientemente immunogenici per scatenare
una forte e duratura risposta immunitaria. Per ovviare a questa problematica,
i peptidi verranno somministrati contemporaneamente all’immunizzazione
con BCG. Tale immunizzazione è una procedura che viene eseguita su
tutti i neonati senza distinzione riguardante lo stato di sieropositività
per HIV. L’immunizzazione con BCG produrrà una sostanziale
attivazione del sistema immunitario che incrementerà la risposta
a peptidi. La ricerca che verrà eseguita durante i trial clinici
per il vaccino di prima generazione darà indicazioni per il miglioramento
di questi prodotti. Possibili aree di sviluppo riguarderanno la possibilità
di addizionare componenti vaccinici per indurre anticorpi anti-HIV neutralizzanti,
di espandere il numero di peptidi o di alterare la struttura chimica dei
complessi peptidici, e di identificare composti immunomodulatori che possano
sostituire l’effetto del BCG.
Componenti del programma. I gruppi che compongono il nucleo di lavoro del
presente programma sono quattro e fanno capo al Prof. L. Montagnier per
la Fondazione Mondiale per la Ricerca e Prevenzione dell’AIDS /UNESCO
(Parigi, Francia), al Prof. V. Colizzi per l’Università di
Roma “Tor Vergata” (Roma, Italia), al Prof. R. Gallo per l’Istituto
di Virologia Umana (Baltimora, MA, USA), al Dr. Lucie Maule per l’Ospedale
di Alepe (Costa D’Avorio).
Abbiamo precedentemente dimostrato che l’espressione del CCR5 è incrementata in macrofagi umani in corso di infezione in vitro ed ex vivo con MTB. Inoltre, tale incremento era associato ad una maggiore suscettibilità all’infezione con HIV. Nel presente studio noi abbiamo focalizzato la nostra attenzione alla popolazione linfocitaria T CD4+. In particolare, abbiamo dimostrato che la proporzione della popolazione linfocitaria T CD4+, esprimente il CCR5 o il CCR3, presente nel polmone era significativamente aumentata in confronto a quella presente nel sangue periferico sia nei pazienti con TB che nei controlli. Tuttavia, se il confronto veniva effettuato tra pazienti e controlli, solo la popolazione linfocitaria T CD4+ CCR5+ era significativamente espansa nel polmone dei pazienti con TB. Inoltre, l’evidenza che tali linfociti T esprimevano marcatori precoci di attivazione, non erano proliferanti, e mostravano una diminuita espressione del CCR5 di membrana, suggerisce fortemente che tale espansione era dovuta ad un preferenziale reclutamento al sito della malattia. Questi risultati suggeriscono che la mucosa respiratoria può fornire bersagli cellulari accessibili ad una preferenziale trasmissione di varianti virali di HIV di tipo R5 e che la tubercolosi può aumentare questo fenomeno.
Ruolo dell’apoptosi indotta da MTB
in monociti/macrofagi.
Abbiamo precedentemente dimostrato che l’apoptosi indotta da MTB in monociti/macrofagi umani è associata alla sopravvivenza del micobatterio piuttosto che alla sua uccisione intracellulare. Il presente studio analizza la possibilità che vie di trasduzione del segnale proinfiammatorie e di apoptosi possano coesistere attraverso un meccanismo mediato dalla caspasi-1. In questo contesto, un inibitore della caspasi-1 (YVAD), ma non della capsasi IV (LEVD) o della capsasi-3 (DEVD) era in grado di inibire fortemente l’apoptosi indotta da MTB. Inoltre, l’attività della caspasi-1 era confermata mediante un incremento della maturazione dell’IL-1?. Tale citochina, insieme al TNF-?, era massicciamente prodotta in corso di infezione ed entrambe venivano inibite dal pre-trattamento con YVAD. Allo scopo di vedere se il TNF-? era attivamente prodotto dalle cellule apoptotiche, veniva eseguita una analisi citofluorimetrica per valutare l’eventuale presenza di un fenotipo apoptotico (Annexina V) in concomitanza alla produzione di citochine proinfiammatorie quali il TNF-?. I risultati indicavano un progressivo incremento nella produzione di TNF-? a carico di cellule Annessina V positive. Abbiamo, quindi, studiato l’eventuale ruolo pro-apoptotico della lipoproteina della parete cellulare di 19-kDa e l’eventuale associazione con la produzione di citochine pro-infiammatorie. A questo scopo, la lipoproteina di 19kDa ricombinante espressa in M. smegmatis ed i ceppi micobatterici MTB e BCG resi knock out per la 19kDa ed il ceppo M. smegmatis esprimente il gene sono stati analizzati per valutare la loro capacità di indurre apoptosi in monociti/macrofagi. I risultati mostravano che la 1ipoproteina di 19kDa era un segnale necessario e sufficiente per l’induzione di apoptosi in corso di infezione da micobatteri. Inoltre, tale segnale era associato alla produzione di IL-1? ma non di IL-6, TNF-?, IFN-?, IL-12, RANTES ed IL-10. Questi risultati indicano che la lipoproteina di 19kDa micobatterica è il principale segnale richiesto per indurre apoptosi ed IL-1? durante i primi stadi dell’infezione con MTB
Ruolo della risposta immunitaria
innata in corso di infezione da M. tuberculosis.
La fosfolipasi D (PLD) macrofagica è stata dimostrata essere coinvolta in alcuni vie di traduzione del segnale coinvolte nell’attivazione di meccanismi micobattericidi. Su queste basi, abbiamo studiato la differente capacità dei macrofagi umani a controllare la crescita intracellulare di un micobatterio patogeno (MTB) e di un micobatterio non patogeno (M. smegmatis, M.sm) e l’abbiamo confrontata alla attività della PLD. I risultati hanno mostrato che M.sm, ma non MTB, induceva livelli significativamente più alti di attivazione enzimatica che era associata al controllo della crescita micobatterica. Inoltre, tale attivazione enzimatica mediava anche l’attività micobattericida indotta da sequenze oligodeossinucleotidiche di tipo CpG. Tutti insieme questi risultati dimostrano una correlazione diretta tra l’attivazione della PLD e la capacità macrofagica di di controllare la crescita intracellulare micobatterica. Infine, poiché la Sfingosina 1-fosfato è stata dimostrata indurre attivazione della fosfolipase D, abbiamo studiato il suo coinvolgimento come possibile induttore di attività antimicrobica innata. I risultati ottenuti dimostrano che la S1P induceva attività antimicobatterica in macrofagi umani infettati da ceppi virulenti di MTB (MTB H37Rv). Inoltre, tale attività era mediata dalla PLD che, a sua volta, promuoveva la maturazione fagolisosomale. Infine, quando iniettata intravena in topi infettati da MTB, la S1P riduceva sia la crescita micobatterica che il danno tissutale polmonare. Questi risultati dimostrano un nuovo ruolo della S1P nella immunosorveglianza anti-microbica.
