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Laboratorio di Biologia Cellulare
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Attività Scientifica
Studi sull’apoptosi (morte cellulare programmata).
Transglutaminasi tissutale o di tipo 2 (TG2).
Ruolo della TG2 nella corea di Huntington.
Glucosilceramide sintasi e reticuloni.
Riduzione del potere metastatico nel melanoma per mezzo di composti polifenolici naturali
Modulazione dell’apoptosi nello sviluppo e nelle patologie del sistema nervoso
Studi sull’apoptosi (morte cellulare programmata).
(M. Piacentini, L. Piredda, M.G. Farrace, S. Oliverio, F. Di Sano, C.
Rodolfo, F. Autuori)
L’apoptosi, è un particolare fenomeno di morte regolata da un preciso programma genetico ed ha notevole importanza in numerosi processi biologici. In condizioni normali, svolge un ruolo fondamentale durante lo sviluppo embrionale, il manteni-mento dell’omeostasi nei tessuti e l’invecchiamento. Sebbene le caratteristiche morfologiche del processo di apoptosi siano ben note, la comprensione dei mecca-nismi molecolari che regolano il fenomeno risulta piuttosto complessa. Lo studio del ruolo svolto dai numerosi geni coinvolti è un campo di ricerca in continua evo-luzione e di grande attualità. Infatti, alterazioni nella regolazione del programma di apoptosi sono state evidenziate in numerose patologie, quali il cancro, l’AIDS e le malattie neurodegenerative.
Transglutaminasi tissutale o di tipo 2 (TG2).
(M. Piacentini, L. Piredda, M.G. Farrace, S. Oliverio,
C. Rodolfo, E. Mormone, F. Autuori))
Negli ultimi anni nel nostro laboratorio si è cercato di identificare e caratterizzare geni coinvolti nella regolazione dell’apoptosi, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Ricerche condotte sia in vivo che in vitro, hanno evidenziato che uno dei geni indotti in modo specifico durante l’apoptosi è quello che codifica per l’enzima Transglutaminasi tissutale o di tipo 2 (TG2). Diversi studi hanno dimostrato come la TG2 possa avere più di un ruolo nella cascata di eventi che portano alla morte della cellula. Nelle prime fasi del fenomeno, l’enzima svolge una funzione regolatoria, indirizzando la cellula o verso la morte o verso la sopravvivenza, mediante l’interazione con altre proteine (es. proteina del retinoblastoma). Nelle fasi tardive, l’attivazione della TG2 catalizza la formazione di un involucro proteico nella cellula morente, la quale acquisisce caratteristiche peculiari di impermeabilità, evitando così il rilascio del contenuto cellulare potenzialmente dannoso per l’organismo. Recentemente, abbiamo confermato come la TG2 svolga un ruolo nell’induzione dell’apoptosi. Infatti, l’iper-espressione dell’enzima in cellule di neuroblastoma umano, aumenta sia l’apoptosi spontanea che quella indotta da agenti esterni. Utilizzando questo sistema cellulare abbiamo inoltre identificato diverse proteine (b-tubulina, istone H2B, GST, etc.) che interagiscono con la TG2. Sebbene questi risultati indichino che la TG2 gioca un ruolo chiave nell’apoptosi, non è stato ancora ben definito quale sia la posizione precisa della TG2 nella cascata di eventi che conducono alla morte cellulare. Dati recenti ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che cellule di neuroblastoma che iper-esprimono la TG2, non solo sono di per sé più sensibili all’apoptosi, ma il processo di morte cellulare diviene caspasi indipendente. Inoltre, tali cellule, presentano differenze marcate nelle caratteristiche ultrastrutturali dei mitocondri, associate a modificazioni drastiche nella funzionalità di tali organelli, anche in assenza di stimoli apoptotici. In accordo con queste osservazioni, abbiamo dimostrato che il 30-40% della TG2 intracellulare si localizza a livello mitocondriale, dove l’enzima modifica post-traduzionalmente varie proteine mitocondriali ed induce uno stato di iper-polarizzazione dell’organello. Inoltre, l’analisi di sequenza ha eviden-ziato che la TG2 contiene nella sua struttura primaria un dominio, che presenta più del 70% di identità con il dominio BH3 presente nei membri della famiglia di Bcl-2. E’ stato dimostrato che un regolazione multipla è tipica degli elementi effettori che si trovano a monte del programma di morte cellulare, come appunto avviene per le proteine contenenti il dominio BH3. Tramite questo dominio la TG2 è in grado di interagire con i membri pro-apoptotici Bax e Bak, e di provocarne sia l’attivazione sia l’oligomerizzazione, funzionando quindi come i membri contenenti il solo dominio BH3 (BH3-only proteins). Le forme oligomerizzate delle due proteine si ritrovano anche in assenza di stimolo apoptotico, suggerendo che questo sia il meccanismo tramite il quale la TG2 accelera il processo di morte a livello mitocondriale. L’analisi delle altre proteine che possono interagire con la TG2, effettuata mediante saggio dei due ibridi in lievito, ha portato all’identificazione di proteine coinvolte nei processi di regolazione della traduzione. Il ruolo svolto dall’interazione della TG2 con queste proteine è al momento oggetto di studio nel nostro laboratorio.
Un’ulteriore linea di ricerca studia il ruolo svolto dalla TG2 nella
Corea di Hun-tington (HD), una malattia neurodegenerativa autosomica dominante
caratterizzata da movimenti involontari, demenza e morte precoce. I sintomi
dell’HD sono correlati con la morte dei neuroni corticali e dello
striato. Il meccanismo alla base della patologia è l’espansione
di un tratto di poliglutammine all’N terminale della proteina huntingtina
(htt). La malattia è associata con la formazione di inclusioni neuronali
intranucleari (NII) che contengono la htt mutata. Il ruolo delle NII nella
patogenesi del HD è ancora controverso. È stato suggerito
che la presenza delle NII causi la disfunzione neuronale. Alternativamente,
le NII potrebbero rappresentare una risposta protettiva nei confronti di
forme altrimenti solubili e più tossiche della huntingtina mutata.
Diversi studi hanno suggerito che l’aggregazione in vitro della htt
possa avvenire attraverso la formazione, catalizzata dalla TG2, di legami
crociati tra le proteine. Abbiamo sviluppato un modello sperimentale per
lo studio in vivo delle basi molecolari del HD incrociando topi transgenici
per l’esone 1 del gene del htt umana (115-150 ripetizioni CAG) e topi
con il gene della TG2 deleto, così da poter chiarire il ruolo svolto
dell’enzima nella degenerazione neuronale. L’assenza di TG2
in animali transgenici HD non previene la formazione degli inclusi neuronali.
Tuttavia questa comporta una drastica diminuzione dei livelli di neurodegenerazione,
nonché un considerevole aumento della vita media degli animali malati
accompagnato da un netto miglioramento delle loro attitudini psicomotorie.
In conclusione, la TG2 ha un ruolo chiave nella morte neuronale che caratterizza
la patogenesi dell’HD e la sua inibizione della attività potrebbe
rappresentare un possibile nuovo approccio terapeutico per la cura della
Còrea.
Un’analisi approfondita dei topi KO per la TG2, ci ha permesso di
individuare una nuova funzione per l’enzima. Infatti, analizzando
la funzionalità mitocondriale abbiamo dimostrato come i topi privi
di TG2 abbiano una ridotta capacità di produzione dell’ATP,
dovuta ad un difetto di assemblaggio delle catene respiratorie. L’analisi
delle proteine componenti le catene respiratorie mitocondriali ha evidenziato
come per alcune di esse si osservi una non corretta formazione di ponti
disolfuro, nei topi KO per la TG2. Recentemente, è stata dimostrata
la capacità della TG2 a funzionare da proteina disolfuro isomerasi
in vitro, le nostre osservazioni sono la prima evidenza di questa attività
in vivo.
Glucosilceramide sintasi e reticuloni.
(M. Piacentini, F. Di Sano, B. Fazi)
Recentemente, è stata messa in evidenza l’importanza di un altro gene, la Glucosil-ceramide sintasi (GCS), nella modulazione del fenomeno apoptotico. Questo enzima svolge un ruolo chiave nel metabolismo dei glicosfingolipidi, componenti delle membrane cellulari coinvolti in diversi fenomeni biologici fondamentali come la proliferazione e il differenziamento cellulare. L’inibizione dell’attività enzimatica porta a variazioni dell’espressione di alcuni geni coinvolti nel controllo della morfologia e delle modalità di crescita cellulare tra i quali RhoA e alcuni membri della famiglia delle MAP chinasi. Inoltre mediante l’utilizzo di varie metodiche abbiamo dimostrato l’interazione tra la GCS e alcuni fattori appartenenti alla famiglia dei reticuloni, proteine presenti sul reticolo endoplasmatico la cui funzione nel differenziamento neuronale risulta ancora poco chiara. Al fine di verificare il ruolo svolto dall’interazione GCS-reticuloni, abbiamo creato un topo transgenico per la proteina RTN e la sua analisi è al momento in corso.
Ruolo delle modificazioni post-traduzionali
delle proteine catalizzata dalle transglutaminasi nelle cellule tumorali
(S.Beninati)
E’ stata evidenziata una correlazione inversa fra la modificazione post-traduzionale delle proteine, indotta da una classe di enzimi noti come transglutaminasi, ed il potere metastatico delle cellule tumorali. La massa tumorale sviluppata in topi singenici (C57BL6/N) ottenuta inoculando cellule della linea di melanoma B16-F10, è stata significativamente ridotta pretrattando le cellule tumorali con un gruppo di sostanze naturali capaci di attivare la transglutaminasi solubile intracellulare. Tra queste sostanze, le metilxantine hanno mostrato un’attività particolarmente spiccata. Il trattamento con teofillina 1 mM delle cellule poi inoculate nei topi, si è mostrato efficace nell’attivazione della transglutaminasi solubile, riducendo di circa il 70% la frequenza di metastasi nell’animale singenico. Al fine di meglio analizzare lo sviluppo delle metastasi da melanoma in vivo, e soprattutto di poter discriminare l’effetto antiproliferativo da quello antimetastatico, abbiamo messo a punto una metodica di analisi morfometrica, grazie alla utilizzazione delle apparecchiature in dotazione al centro di analisi dell’immagine dell’Università. Con questa analisi computerizzata, è possibile per la prima volta, discriminare e valutare in vivo la capacità di inibizione esercitato da una sostanza sull’invasività e sulla proliferazione di cellule di melanoma murino. Il meccanismo d’azione delle metilxantine nel controllo del potere metastatico non è noto, ma valutazioni ottenute per mezzo di questa nuova tecnica di analisi dell’immagine, sembrano suggerire una dualità d’azione. La prima esercitata nella fase di attacco dell’organo bersaglio, quindi nell’invasione e la seconda svolta all’interno dell’organo stesso , inibendo la proliferazione delle cellule tumorali. Sulla base di questi risultati è iniziata una nuova serie di esperimenti tesi a raccogliere dati sufficienti per proporre le metixantine come agenti differenzianti antineoplastici. Infatti, il ruolo delle metilxantine, in particolare della teofillina, nel controllo in vivo della crescita del melanoma, è stato studiato in topi singenici inoculati con cellule di melanoma e trattati con il farmaco. I risultati hanno dimostrato una notevole riduzione del numero di metastasi formate nel polmone e nel fegato, nonchè un aumento significativo della sopravvivenza degli animali trattati rispetto a quelli di controllo. Tra l’altro, il coinvolgimento diretto della transglutaminasi nell’effetto antineoplastico è stato dimostrato recentemente in topi trattati con un plasmide contenente il gene per l’enzima. Questi esperimenti preliminari hanno dimostrato che il numero di metastasi polmonari, parametro correlato all’invasività delle cellule tumorali, era significativamente ridotto negli animali trattati, mentre il volume medio delle colonie metastatiche, correlato alla proliferazione tumorale, è rimasto immutato, suggerendo un cospicuo effetto antiinvasivo, più che antiproliferativo, dell’attivazione della transglutaminasi.
Negli ultimi decenni, molta importanza è stata data ai composti polifenolici delle piante nel controllo delle patologie tumorali. Tali molecole, data la loro diversa natura, esplicano diverse funzioni nella pianta, pur possedendo una comune origine biosintetica. Il gruppo di composti numericamente più rappresentati e a distribuzione più generale è quello dei flavonoidi, pigmenti accumulati nei vacuoli, o anche nei cromoplasti e nei cloroplasti. Costituiscono una grande famiglia di metaboliti secondari comprendenti antocianine, flavonoli, flavoni, catechine, flavanoni, e molti di loro sono presenti in alte concentrazioni nei diversi tessuti come coniugati glicosidici. I flavonoidi, in base ai diversi sostituenti e alla saturazione degli atomi di carbonio C2-C3 nell’anello B del gruppo benzopirone, comprendono flavanoli, flavoni, isoflavoni e flavanoni. Molte evidenze sperimentali dimostrano che i flavonoidi esercitano importanti effetti su diversi sistemi biologici. Infatti, sono utilizzati come protettivi dell’integrità vascolare, come antiosteoporotici, antiepatotossici ed antiinfiammatori. Hanno anche effetti benefici sull’apparato gastrointestinale, funzionando come antiulcerogenici, antispasmodici, agenti antisecretori o antidiarroici. La maggior parte dei flavonoidi è risultata di particolare importanza nella dieta umana in quanto agiscono come antiossidanti. Un gruppo di flavoni e flavonoidi metilati mostrano attività antineoplastica. Molti composti polifenolici sono stati dimostrati interferire con enzimi implicati con la trasduzione dei segnali mitogenici intracellulari, con l’inibizione della fosfodiesterasi e della protein chinasi cAMP-dipendente. Inoltre, ci sono anche molte evidenze che dimostrano che alcuni flavonoidi inducono il differenziamento e l’apoptosi in alcune linee tumorali, ma non è stato tuttora indagato se i flavonoidi sono in grado di aumentare l’attività della TGasi intracellulare in cellule tumorali. A tale proposito, è sempre crescente l’interesse suscitato dai flavonoidi come agenti antineoplastici. I flavonoidi rappresentano attualmente uno degli elementi in grado di interferire con la crescita di svariate linee cellulari tumorali. Infatti, uno degli effetti noti dei flavonoidi su cellule tumorali in vitro è un disturbo delle normali attività proliferative delle cellule trattate. Il flavonolo quercetina, ad esempio, manifesta un’attività antineoplastica nei confronti di vari tipi cellulari di carcinoma, come pure la genisteina, un isoflavone di cui è ricca la soia, che possiede proprietà anticancerose e preventive. Inoltre, è stato osservato che l’azione antiproliferativa della quercetina su cellule K-562 comporta induzione di apoptosi, induzione al differenziamento, soppressione degli oncogeni Ki-ras e c-myc e rapida riduzione della concentrazione di inositol-trifosfato. Il grande interesse rivolto in questi ultimi anni agli effetti antineoplastici dei flavonoidi, utilizzati a concentrazioni che non provocano una elevata tossicità cellulare, suggerisce che anche i composti polifenolici in generale potrebbero, come le metilxantine, svolgere un ruolo importante nel controllo della capacità proliferativa e metastatica dei tumori, per mezzo dell’induzione al differenziamento, del blocco dei segnali di proliferazione cellulare, o dell’apoptosi. Nel nostro laboratorio sono in corso esperimenti per saggiare l’effetto di diversi flavonoidi ed antocianine sulla capacità di ridurre il potere metastatico di cellule di melanoma murino della linea B16-F10 ed umano della linea SKMEL-110, studiandone la capacità di aumentare, da una parte, il grado di differenziamento, e, dall’altra, limitando la capacità delle cellule di migrare attraverso la matrice extracellulare, di invadere le membrane basali e di colonizzare i tessuti bersaglio. La sperimentazione in vivo riguarderà invece l’inoculazione di cellule tumorali in topi da laboratorio trattati oralmente con flavonoidi, e la successiva analisi istologica e morfometrica sia della crescita del tumore primario che della neovascolarizzazione del tumore stesso e anche del numero di metastasi formate negli organi bersaglio.
Modulazione dell’apoptosi nello sviluppo
e nelle patologie del sistema nervoso
(F. Cecconi)
L’apoptosi è considerata la forma principale di morte cellulare
nelle neurodegenerazioni. Apaf1 svolge un ruolo chiave nello sviluppo
del cervello, come indicato dall'accumulo di cellule nervose addizionali
negli embrioni nei quali il gene Apaf1 e’ stato inattivato. L'attivazione
delle caspasi è stata correlata con la patogenesi di molti disordini
neurologici quali il morbo di Alzheimer (AD) e la sclerosi laterale amiotrofica
(SLA). Poiché l'attivazione delle caspasi può richiedere
la formazione dell’apoptosoma, è plausibile che Apaf1 possa
partecipare alla morte cellulare che conduce all'AD ed alla SLA. Abbiamo
scoperto che linee cellulari con molte delle caratteristiche dei precursori
neurali che difettano di Apaf1 (ETNA) evadono dalla morte cellulare provocata
dagli induttori tipici di alcune neurodegenerazioni, quali il peptide
beta-amiloide (Abeta, tipico dell'AD) ed una forma mutante della superossido
dismutasi 1 (SOD1, tipica delle forme familiari di SLA). Cellule ETNA
che evadono dall’apoptosi mantengono la loro integrita’ mitocondriale
ed il loro potenziale differenziativo. Le nostre conclusioni consentono
di ipotizzare un meccanismo neuroprotettivo modulato da specifici inibitori
dell’apoptosoma.
La nostra analisi delle funzioni del gene Apaf1 non si ferma pero’
alle neurodegenerazioni. Abbiamo caratterizzato i suoi ruoli anche nella
morfogenesi dell’orecchio interno e stiamo affrontando studi sulla
sua importanza nell’ontogenesi del cancro. Stiamo inoltre generando
due modelli animali per studiare l’apoptosi nei tessuti dell'adulto
e nelle malattie neurodegenerative per mezzo della ricombinazione omologa
tessuto-specifica nel topo, basata sul sistema Cre-loxP. La deregolazione
di Apaf1 e’ una caratteristica di entrambe le linee murine. La prima
linea presenta un allele inducibile che sovraesprime il mRNA per Apaf1;
viceversa, la seconda linea presenta una deficienza di Apaf1 condizionalmente
inducibile. Come obiettivo, questi modelli murini devono essere incrociati
con i modelli murini per AD ed SLA in modo da individuare i meccanismi
di morte mediati da Apaf1 ed occorrenti all'inizio e durante la progressione
di queste malattie.
Personale Tec/Amm
Tecnico EP3
Tecnico D4
Tecnico D3
Tecnico C1
